RSUSSH 2020
NA20-067 การพัฒนากระบวนการผลิตพอลิไฮดรอกซิลบิวทีเรตด้วยกระบวนการหมักบนอาหารแข็ง โดยแบคทีเรีย Bacillus megaterium SWU01
นำเสนอโดย: แพรวสุภา เหล่าศิริ
มหาวิทยาลัยศรีนครินทรวิโรฒ, ไทย
Abstract
พอลิไฮดรอกซีบิวทีเรต หรือ พีเอชบี เป็นเทอโมพลาสติกชีวภาพ ที่สามารถผลิตได้จากแบคทีเรียหลายชนิดโดยแบคทีเรียผลิตและสะสมพีเอชบีเพื่อเป็นแหล่งแหล่งพลังงานสำรองให้กับเซลล์เมื่ออยู่ในสภาวะเครียด งานวิจัยนี้มีจุดมุ่งหมายเพื่อพัฒนากระบวนการผลิตพีเอชบีโดยแบคทีเรีย Bacillus megaterium SWU01 ด้วยกระบวนการหมักบนอาหารแข็งที่มีส่วนผสมของกากน้ำตาล ผลการหาสภาวะที่เหมาะสม พบว่า การเพาะเลี้ยงโดยใช้ปริมาณหัวเชื้อเริ่มต้นที่ค่าดูดกลืนแสงที่ความยาวคลื่น 600 นาโนเมตร เท่ากับ 1 หน่วย ลงบนอาหาร NB ที่มีส่วนประกอบของกากน้ำตาลเข้มข้นร้อยละ 2 โดยมวลต่อปริมาตร โดยมีปริมาตรอาหารเลี้ยงเชื้ออยู่ที่ 20 mL ต่อจานเพาะเชื้อ และบ่มที่ 37 oC เป็นเวลา 24 ชั่วโมง ได้ปริมาณพีเอชบีได้เท่ากับ 5.81 ± 0.32 g/L จากนั้นทำการขยายขนาดการผลิตเพื่อทำการเปรียบวิธีการสกัดพีเอชบีจากเซลล์แบคทีเรีย พบว่าการสกัดด้วยระบบตัวทำละลายผสม (อะซิโตน/เอทานอล/โพรพิลีนคาร์บอเนต อัตราส่วนโดยปริมาตรเท่ากับ 1:1:1) ได้ปริมาณพีเอชบีมากที่สุด เท่ากับ 0.22 กรัมต่อกรัมน้ำหนักเซลล์แห้ง จากผลการทดลองจะเห็นได้ว่า สภาวะที่เหมาะสมดังกล่าวเป็นอีกทางเลือกหนึ่งในการผลิตพลาสติกชีวภาพโดยใช้ต้นทุนต่ำและเป็นกระบวนการผลิตที่ส่งผลกระทบต่อสิ่งแวดล้อมน้อย
Citation format:
แพรวสุภา เหล่าศิริ, ปิยะดา จิตรตั้งประเสริฐ, ธิปชัย วัฒนวิจารณ์, และศิริขวัญ พลประทีป. (2020). การพัฒนากระบวนการผลิตพอลิไฮดรอกซิลบิวทีเรตด้วยกระบวนการหมักบนอาหารแข็ง โดยแบคทีเรีย Bacillus megaterium SWU01. เอกสารสืบเนื่องจากการประชุมระดับชาติมหาวิทยาลัยรังสิต ประจำปี 2563. วันที่ 1 พฤษภาคม 2563.QUESTIONS & ANSWERS
1. เนื่องจากผู้วิจัยเลือกเวลาในการบ่มเริ่มต้นที่ 24 ชั่วโมง และพบว่า เมื่อเพิ่มเวลาในการบ่มกลับทำให้ได้พีเอชบีน้อยลง ไม่ทราบว่าผู้วิจัยได้ทดลองทำที่เวลาน้อยกว่านี้ไหม เพราะถ้าเวลาน้อยกว่านี้และผลผลิตมากกว่าก็น่าจะส่งผลดีต่อความสะดวกในการผลิตพีเอชบี
2. เหตุใดเมื่อความเข้มข้นของแบคทีเรียเริ่มต้นที่ 1.25 g/L จึงได้ผลการทดลองที่แตกต่างจากปริมาณแบคเรียเริ่มต้นที่ 1 และ 1.5 g/L อย่างชัดเจน
3. เหตุใดผู้วิจัยจึงเลือก Acetone/ethanol/propylene carbonate ที่อัตราส่วน 1:1:1 เพื่อใช้สกัด ใช้หลักการในการปรับอัตราส่วนอย่างไร
1. การทดลองนี้ เป็นการสกัดด้วยวิธีเดียว คือใช้การสกัดด้วยตัวทำละลาย เพียงแต่เป็นตัวทำละลายชนิดต่างๆ ดังนั้นใช้คำว่าเปรียบเทียบวิธีการสกัด.จึงดูแปลกๆ ควรเป็นเปรียบเทียบตัวทำละลายในการสกัดมากกว่า
2. ขอทราบเหตุผลในการเลือกชนิดของตัวทำละลาย ได้แก่คลอโรฟอร์ม โซเดียมไฮโปคลอไรต์ หรือ Acetone/ethanol/propylene carbonate ด้วยค่ะ
ตอบคำถามของ ASSISTANT PROFESSOR DR. DUANGRUTHAI SRIDAENG (CHAIRPERSON) ค่ะ
1. สาเหตุที่ผู้วิจัยบ่มเชื้อเริ่มต้นที่ 24 ชั่วโมง เนื่องจากเคยลองเก็บที่ 18 ชั่วโมงแล้วพบว่าแบคทีเรียเจริญเติบโตไม่เต็มผิวหน้าของอาหารเลี้ยงเชื้อ ทำให้ปริมาณเชื้อที่ได้มีปริมาณน้อย และแบคทีเรียอาจยังมีการใช้ micronutrients ในอาหารเลี้ยงเชื้อยังไม่หมด ทำให้การเก็บเชื้อแบคทีเรียที่เวลาเร็วกว่า 24 ชั่วโมงอาจทำให้สูญเสียอาหารเลี้ยงเชื้อที่แบคทีเรียใช้ยังไม่หมดไปค่ะ
2. จากผลการศึกษาความเข้มข้นของเชื้อเริ่มต้น (Inoculum Size) ผู้วิจัยขออนุญาตยอมรับว่ายังคงสงสัยในผลการทดลองนี้อยู่ เนื่องจากความเข้มข้นของเชื้อแบคทีเรียเริ่มต้นที่ใช้ควรเหมาะสมกับปริมาณคาร์บอนในอาหารเลี้ยงเชื้อ หากเชื้อเริ่มต้นมีความเข้มข้นมาก อาจเกิดการแข็งขันแย่งอาหารของจุลินทรีย์เอง ทำให้เกิดการเจริญเติบโตและสะสมพีเอชบีน้อยลง จากการทดลองพบว่า ความเข้มข้นของเชื้อเริ่มต้นที่ OD600 = 1 ทำให้เกิดการสะมพีเอชบีมากที่สุด และหากเชื้อมีความเข้มข้นมากขึ้น แบคทีเรียก็ควรมีการสะสมพีเอชบีน้อยลงด้วย แต่จากผลการทดลองที่ความเข้มข้นของแบคทีเรียเริ่มต้นที่ 1.25 พบว่า ปริมาณเชื้อแบคทีเรียและพีเอชบีที่ได้มีปริมาณลดลงอย่างชัดเจน แล้วกลับมาเพิ่มขึ้นเมื่ออีกครั้งเมื่อทดลองความเข้มข้นของแบคทีเรียเริ่มต้นที่ 1.5 ปัญหาดังกล่าวอาจเกิดจากตัวผู้วิจัยเองหรือเครื่องมือที่ใช้ในการทดลอง หากมีโอกาสผู้วิจัยจะกลับไปทำการทดลองศึกษาตัวแปรนี้ใหม่อีกครั้งค่ะ
3. เนื่องจากพอลิเมอร์แต่ละชนิดมีสภาพขั้วที่แตกต่างกัน ทำให้ความสามารถในการละลายในตัวทำละลายแต่ละชนิดแตกต่างกันด้วย และจากงานวิจัยก่อนหน้าพบว่า Acetone/ethanol/propylene carbonate ที่อัตราส่วน 1:1:1 เป็นระบบตัวทำละลายผสมที่มีสภาพขั้ว (polarity index) เหมาะสมกับพอลิเมอร์ประเภทพีเอชบีมากที่สุด และนอกจากนี้ในการสกัดพีเอชบีจากเซลล์แบคทีเรีย จำเป็นที่จะต้องใช้ความร้อนในการสกัดถึง 120 oC ดังนั้นการใช้ตัวทำละลายที่มีจุดเดือดสูงร่วมด้วยจึงทำให้ประสิทธิภาพในการสกัดดียิ่งขึ้นค่ะ
ขอบคุณค่ะ
ตอบคำถาม ผศ.ดร.บุณยรัศมิ์ สุขเขียว (CHAIRPERSON) ค่ะ
1. สาเหตุที่ใช้คำว่าเปรียบเทียบวิธีการสกัดเนื่องจากการทดลองเป็นการสกัดด้วยตัวทำละลายเช่นกันทั้ง 3 แบบ แม้ว่าจะเป็นการสกัดด้วยตัวทำละลายเหมือนกันแต่เนื่องจากแต่ละวิธีมีวิธีการสกัดไม่เหมือนกันทั้งหมด เช่น การกระทำกับเซลล์แบคทีเรียก่อนการสกัดต่างกัน โดยการสกัดด้วยโซเดียมไฮโปคลอไรด์ เป็นการเติมตัวทำละลายลงไปสกัดกับเซลล์ได้เลยโดยตรง การสกัดด้วยคลอโรฟอร์มจะสกัดด้วยวิธีการรีฟลักซ์ และการสกัดด้วยตัวทำละลายผสมระบบอะซิโตน/เอทานอล/โพรพิลีนคาร์บอเนตได้มีการ sonication ก่อนนำมารีฟลักซ์ ทำให้การสกัดแต่ละแบบมีวิธีที่ใช้ในการสกัดต่างกัน และผู้วิจัยมีจุดประสงค์ในการศึกษาวิธีที่ทำให้ได้ปริมาณพีเอชบีออกมามากที่สุด ผู้วิจัยจึงคิดว่าอาจจะยังใช้คำว่าเปรียบเทียบตัวทำละลายที่ใช้ในการสกัดเลยยังไม่ได้ค่ะ
2. สาเหตุที่ทำการศึกษาวิธีการสกัดโดยใช้ตัวทำละลาย 3 ชนิดนี้เนื่องจาก
-ในการสกัดพีเอชบีโดยทั่วไปนิยมใช้คลอโรฟอร์มในการสกัดเนื่องจากให้ปริมาณผลผลิตจากการสกัดในปริมาณมากและพอลิเมอร์ที่ได้มีความบริสุทธ์สูง ผู้วิจัยจึงเลือกศึกษาการสกัดแบคทีเรีย Bacillus megaterium SWU01ด้วยตัวทำละลายนี้ด้วย เนื่องจากแบคทีเรียคนละชนิดอาจมีโครงสร้างของผนังเซลล์ที่แตกต่างกัน อาจให้ผลการทดลองที่ต่างไปจากงานวิจัยก่อนหน้า
-ผู้วิจัยเลือกศึกษาการสกัดด้วยโซเดียมไฮโปคลอไรต์ เนื่องจากเป็นวิธีการสกัดที่ทำได้ง่าย เพียงเดิมตัวทำละลายไปในเซลล์ของแบคทีเรีย แล้วโซเดียมไฮโปคลอไรต์จะไปทำลายผนังเซลล์ของแบคทีเรียทำให้เกิดการปลดปล่อยพีเอชบีออกมาจากเซลล์ และหลังจากนั้นก็ทำการล้าง cell debris ออกก็จะได้พีเอชบีแล้วค่ะ ซึ่งหากได้ผลผลิตดีด้วยก็จะทำให้การผลิตพีเอชบีในเชิงพานิชย์ทำได้ง่ายด้วยค่ะ ผู้วิจัยเลยเลือกศึกษาวิธีนี้ด้วย
-การสกัดด้วยAcetone/ethanol/propylene carbonate ซึ่งเป็นระบบตัวทำละลายผสม ซึ่งข้อดีของระบบตัวทำละลายผสมก็คือ เรายังสามารถปรับอัตราส่วนที่ทำให้สภาพขั้วของตัวทำละลายใกล้เคียงกับสภาพขั้วของพอลิเมอร์นั้นๆได้ ดังนั้นผู้วิจัยจึงสนใจที่จะนำระบบตัวทำละลายผสมมาใช้การการสกัดพีเอชบีออกจากเซลล์ของแบคทีเรียค่ะ และพบว่าระบบตัวทำละลยผสมนี้สามารถให้ผลผลิตมากและส่งผลกระทบต่อสิ่งแวดล้อมน้อยกว่ากระบวนการผลิตทั่วไปที่นิยมใช้คลอโรฟอร์มในการสกัดด้วยค่ะ
ขอบคุณค่ะ
ขอบคุณค่ะ
เป็นงานวิจัยที่น่าสนใจและมีประโยชน์
มีข้อสงสัยเพิ่มเติมเล็กน้อยว่าจากผลการศึกษาหาสภาวะที่เหมาะสมในการผลิตพีเอชบี (สไลด์ที่ 21) ซึ่งแสดงถึงปริมาณของพีเอชบีและน้ำหนักเซลล์แห้ง อยากทราบว่าน้ำหนักของพีเอชบีที่นำมาเปรียบเทียบกันในขั้นตอนนี้สกัดออกมาด้วยกระบวนการใดครับ
ตอบคำถาม ธีรนนท์ ออประยูร (PARTICIPANT)
ขอบคุณที่สนใจค่ะ
สำหรับวิธีการสกัดเพื่อศึกษาสภาวะที่เหมาะสม ผู้วิจัยใช้วิธีการสกัดด้วยโซเดียมไฮโปคลอไรต์ค่ะ เนื่องจากเป็นวิธีที่ทำได้ง่ายที่สุดเมื่อเทียบกับทั้ง 3 วิธีค่ะ